|
ДНК в домашних условиях
Наследственность, гены, ДНК... Кажется, эти слова уже
давно перестали быть научными терминами, вошли в
повседневную жизнь и знакомы теперь каждому
старшекласснику, не говоря уж о студентах. Но никакой
ДНК большинство из нас никогда не видело, хотя увидеть
ее — дело вполне реальное даже в домашних условиях. В
одной из генетических лабораторий на стене висит, к
примеру, вот такая инструкция:
Как самому
выделить ДНК.
1. Возьмите
что-то, что содержит много ДНК. Например, фасоль (но
можно свиную печень, рыбные молоки или редиску).
2. Положите в
миксер около 100 мл (полстакана) этого продукта,
добавьте 1/8 чайной ложки соли и 220 мл (стакан)
холодной воды. Взбивайте в течение 20 секунд. Миксер
«сварит» вам фасолево-клеточный суп.
3. Процедите
смесь через ситечко или кусок марли или капрона (чулок
вполне подойдет).
В полученную
мякоть добавьте 1/6 от ее количества (это будет примерно
2 столовые ложки) жидкого моющего средства (для посуды,
например) и хорошо размешайте. Оставьте на 8-10 минут.
4. Разлейте
жидкость по стаканам или другим стеклянным посудинам,
чтобы в каждой было заполнено не больше 1/3 объема.
5. Добавьте в
каждую пробирку по чуть-чуть либо сока, выжатого из
ананаса, либо раствора для контактных линз и осторожно
встряхните, переворачивая и наклоняя пробирку (если
будете трясти слишком рьяно, разломаете ДНК и ничего не
увидите).
6. Наклоните
пробирку и медленно влейте в нее немного этилового
спирта, чтобы он образовал слой поверх фасолевой смеси.
Лейте, пока спирта и смеси не окажется поровну. ДНК
всплывет наверх в виде хлопьев.
7. Деревянной
палочкой (карандашом) выловите их и рассмотрите под
микроскопом.
Для научных
работников эта инструкция — в какой-то степени шутка и
никто из них ДНК таким способом не выделяет, а между тем
если и вправду воспользоваться ею, то все получится!
Выход ДНК будет, правда, невелик, а вещество - не
особенно чистым, но увидеть в микроскоп длинные тонкие
нити — кристаллы ДНК — вполне возможно.
Что же
происходит с фасолью или свиной печенью в процессе
описанных манипуляций и почему в конечном счете ДНК
оказывается отделенной от всех остальных веществ,
которых в клетке великое множество?
1.Выбор объекта.
ДНК, как
известно, есть в каждой клетке, а значит, выделить ее
можно из любой ткани - даже из костей животных, чешуи
рыб или древесины, где клеток не так уж много по
сравнению с объемом внеклеточного вещества.
Во всех тканях
организма как животного, так и растения, ДНК, как
правило, одинакова. Отличаются эти ткани тем, что в
одних из них помимо вещества наследственности больше
почти ничего нет (молоки селедки), а в других, таких,
как костная ткань, содержание ДНК относительно невелико.
В общем, если
перед исследователем не стоит какой-то специальной
задачи, он старается выбрать для работы ткань, в которой
мало межклеточного вещества и много самих клеток. Причем
желательно, чтобы ткань легко распадалась на эти
составляющие, а клетки не были перегружены белками (как
мышечные), липидами (как жировые) или полисахаридами
(как клетки мозга).
2.
Дробим ткань на клетки.
В миксере ткань,
из которой мы собираемся добыть вещество
наследственности, распадается на отдельные клетки: чтобы
механически разорвать связи между ними требуется, как
правило, гораздо меньше усилий, чем для того, чтобы
повредить саму клетку. И поскольку при нашем способе
выделения ДНК требуются более или менее целые,
неповрежденные клетки, ясно, что консервированный
горошек, кукуруза или соленая селедка для такого
эксперимента не годятся, — лучше уж взять что-нибудь
свежезамороженное, если вы уверены, что продукт не
размораживали в процессе хранения несколько раз.
А немного соли
нужно добавить в раствор для того, чтобы клетки не
полопались раньше времени: давление внутреннего
содержимого на клеточную мембрану изнутри уравновешивают
давлением соляного раствора снаружи.
3. Высвобождаем макромолекулу
Что касается
фильтрации, то она нужна для того, чтобы механически
удалить из клеточной суспензии всевозможные примеси, в
том числе, крупные куски ткани — все равно те вещества,
которыми мы собираемся обрабатывать смесь, не смогут
проникнуть глубоко внутрь таких конгломератов, и для
выделения ДНК они окажутся бесполезными.
А обработать
полученные клетки следует, в первую очередь,
каким-нибудь детергентом. Средство «Ферри», способное,
согласно рекламе, легко отмыть самую жирную посуду,
годится и для того, чтобы наделать больших дырок в
липидной мембране как самой клетки, так и ее ядра. Если
нет жидкого моющего средства, можно сделать
концентрированный раствор стирального порошка — тоже
подойдет.
В результате такой обработки все клеточное содержимое
вывалится наружу и окажется в растворе, который
сделается при этом очень вязким, тягучим и существенно
более прозрачным, чем была клеточная суспензия.
Изменение консистенции раствора — верный знак того, что
лизис прошел успешно.
4. Тут все ясно и без комментариев -
не наливайте
слишком много раствора в емкость, туда предстоит еще
много чего налить, к тому же, если смеси будет в
избытке, ее будет трудно перемешать.
5. Освобождаемся от белков
Чего только нет
в нашей смеси! Однако белков здесь - больше всего,
причем именно они образуют самые прочные комплексы с
ДНК. Существуют методики, когда белки удаляют из
раствора в несколько этапов. Например, часть из них
легко денатурирует и выпадает в осадок при добавлении
концентрированных растворов солей. В лабораторных
условиях такие приемы прекрасно работают, а от осадка
исследователи освобождаются, помещая пробирки на
несколько минут в центрифугу.
Мы сразу же
перейдем к очистке ДНК от остаточных белков с помощью
специальных ферментов, способных разрушать эти молекулы.
Именно такие вещества содержит сок ананаса. Сами они -
тоже белки, поэтому ананас, из которого выжимают сок,
должен быть свежим: у ферментов нет ни малейшего шанса
сохраниться неизменными в компоте или в консервированном
продукте. Что же касается раствора для очистки линз, то
если вы собираетесь использовать его - не забудьте
положить таблетку для удаления белковых отложений! Сами
по себе растворы для хранения контактных линз никаких
активных веществ не содержат — иначе и нашим глазам не
поздоровилось бы.
О том, что ферменты сработали,
можно судить по уменьшению вязкости раствора. Если этого
не происходит, поместите смесь в теплое место (примерно
37C) на полчаса, иногда может потребоваться добавить
больше ананасового сока или раствора для очистки линз.
6. Осаждаем ДНК из раствора
Теперь ДНК
плавает в растворе сама по себе. Белки больше не
цепляются за нее, хотя обломков всевозможных молекул в
смеси по-прежнему много. В лабораторных условиях эти
ненужные фрагменты убирают, тщательно перемешивая
раствор с фенолом и/или хлороформом. После
центрифугирования внизу пробирки оказываются фенол и/или
хлороформ с растворенными в них белками, а вверху —
водная фаза, содержащая ДНК. Водную фазу собирают в
отдельную пробирку и дальше работают уже с относительно
чистым раствором.
За неимением
центрифуги и органических растворителей, работа с
которыми требует к тому же специальных мер безопасности,
этот этап очистки в домашних условиях приходится
пропустить и осаждать ДНК прямо из «грязного» раствора.
Заметим сразу —
заменить этиловый спирт водкой или духами нельзя: если
концентрация спирта будет низкой и упадет при смешивании
с водной фазой до 60-65%, ДНК в кристаллическое
состояние не перейдет.
Отчасти именно по этой причине наливать спирт в пробирку
с ДНК-содержащей смесью следует осторожно, наслаивая его
сверху. Тогда нижние слои спирта частично смешаются с
раствором ДНК, начнется процесс кристаллизации
нуклеиновых кислот, и они всплывут на поверхность (где
спирт более концентрированный) в виде хлопьев.
Если же налить спирт сверху не
получится и все безнадежно перемешается, то при малом
количестве этанола у вас вообще ничего не получится, а
при большом начнет кристаллизоваться не только ДНК: в
осадок выпадут и остатки белков, и кое-что еще из
исходного содержимого клеток.
7. Что же мы получили? (см.рисунок ниже)
Чистые кристаллы
ДНК похожи на клубки спутанных нитей, но не надо
забывать, что вы видите именно кристаллы вещества, а не
его макромолекулы, и сказать по их внешнему виду, какие
гены содержит выделенная вами нуклеиновая кислота,
конечно, невозможно. Чтобы узнать это, придется снова
растворять ДНК. Впрочем, «прочесть» последовательность
нуклеотидов в домашних условиях, увы, невозможно: для
этого нужны не только специальные приборы, но и дорогие
реактивы.
Однако если вы
уже хорошо рассмотрели кристаллы и они успели
подсохнуть, можете понаблюдать за тем, как ДНК
растворяется. Она в начале набухает, становясь похожей
на студенистую медузу, и лишь спустя несколько дней
раствор делается однородным.
Процесс можно
ускорить, если пробирку почаще встряхивать.
Желаю успехов начинающим генетикам и молекулярным
биологам!
Материал подготовил: учитель биологии НОУ СОШ «ВЕНДА»
Ледуховский Н.В.
|
